可定製基因組時代的藥物發現:CRISPR革命的意義。

2014年7月8日

CRISPR/Cas9系統使編輯基因組變得前所未有的容易和方便,爲藥物發現研究人員在設計和開發篩選試驗時提供了創造性的精確控制。CRISPR/Cas9的應用促進了合作,在從被忽視和罕見病到癌症和基因治療等不同領域取得了關鍵進展,並有可能改變藥物發現的格局。

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不可預知的CRISPR發現之路

在發現CRISPR/Cas9後不到兩年的時間裏,CRISPR/Cas9在生物醫學的各個領域掀起了研究熱潮,對人類健康產生了重要影響。儘管如此,CRISPR/Cas9作爲一種精準靶向基因組編輯系統的發現,卻是一條漫長而迂迴的道路。從20世紀80年代開始,日本大阪大學的中田篤夫博士及其同事觀察到了大腸桿菌 基因組中的重複現象,但沒有辦法瞭解其生物學功能[1]。直到2007年,法國丹尼斯克(現在的杜邦公司)的Philip Horvath博士和他的團隊在尋找保護酸奶中的細菌免受病毒感染的因素時,偶然發現了這些基因組區域的功能。他們發現,具有重複基因組段(其周圍的序列與病毒DNA相匹配)的細菌能更好地適應感染,作爲一種原始的先天免疫力[2]。其意義是巨大的--這個系統可以實現DNA的序列特異性靶向,如果能重新用於可編程基因組編輯,將具有巨大的價值,這是生物醫學研究長期追求的目標。唯一缺乏的是確定負責結合和切割DNA的酶。2012年8月,加州大學伯克利分校的Jennifer Doudna博士和瑞典Umea大學的Emmanuelle Charpentier博士小組的洲際合作,揭示了Cas9內切酶家族在以單個RNA分子爲目標時,能夠在特定位點切割DNA的能力[3]。隨着一個誘導雙鏈DNA斷裂的RNA導向系統在手,全世界的科學家們開始以前所未有的便捷性、特異性和高效性進行基因組編輯,爲未來的藥物發現提供了重要進展的樣本。

什麼是CRISPR?

CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)指的是細菌基因組的位點,結合了要靶向的DNA。Cas9(CRISPR關聯蛋白9核酶)是一種內切酶,通過小RNA編程來切割DNA。自其被發現以來,研究人員已經制作了Cas9酶的改良形式,以實現幾種定製化應用。1)創造基因敲除(用非同源末端連接),2)有針對性地替換特定的鹼基對(用同源定向修復),3)上調基因(通過融合到激活域),4)基因組修飾(通過融合到DNA或染色質修飾酶),5)能夠對特定的基因位點進行成像(通過融合到熒光蛋白)[4]。

到目前爲止,CRISPR/Cas9是如何應用於生物醫學創新的?

CRISPR/Cas9系統最令人激動的應用之一是通過功能基因組篩選確定治療的新靶點。其中兩個例子包括篩選出炭疽和白喉中毒的人類基本基因[5]和癌症抗藥性發展所需的基因[67]。CRISPR還被用於驗證高通量測序分析耐藥性腫瘤產生的假設[8]。CRISPR/Cas9所提供的基因組編輯選項將爲複雜的化學基因組學研究打開大門,例如在人類疾病模型中同時篩選同一靶點的基因敲除、點突變和過度表達。這將導致有趣的信息學挑戰,從大量的數據收集工作中學習。如果能夠特異性地滅活一個基因或研究手術突變的效果,靶點驗證和機理研究將變得更加容易,這對於癌症研究來說是一個特別重要的目標,這種技術可以應用於整個組織特異性癌症細胞系[9]。

CRISPR/Cas9可用於修改基因組,用於基因和細胞替代療法。最近,研究人員將CRISPR/Cas9注射到成年Fah突變小鼠的肝臟中,並能逆轉這種人類疾病遺傳性酪氨酸血癥模型的表型[10],讓人們看到了CRISPR/Cas9通過成人基因組工程直接治療的潛力。

除了人體細胞外,CRISPR/Cas9使研究人員能夠對以前難以解決的生物體進行基因改造。最近,研究人員將CRISPR/Cas9應用於人類瘧疾寄生蟲P.falciparum,揭示了新的靶點和耐藥機制[11]。

最後,CRISPR/Cas9在細菌中的作用仍在緊張研究中。隨着我們對該系統自然功能的理解越來越深入,我們可能會發現新的可能性來利用。例如,CRISPR在多種耐藥菌和耐藥結核病的適應性中的作用目前正在研究中[1213]。

合作將如何提升CRISPR在藥物發現中的應用?

與ZFNs、TALENs和RNAi等競爭對手的基因修飾技術相比,CRISPR/Cas9的衆多優勢使其在生物醫學研究中具有巨大的應用潛力。然而,目前仍處於早期階段,CRISPR/Cas9的脫靶效應和最佳遞送方法仍存在問題。因此,科學界必須繼續共同努力,瞭解並解決這些潛在問題。CRISPR/Cas9將加速新的疾病模型的產生和基因功能的快速鑑定,爲高通量篩選、靶點驗證和藥物開發創造了許多新的機會,也需要廣大遺傳學家、細胞生物學家和化學家的貢獻。自CRISPR/Cas9作爲生物醫學研究的工具首次問世以來,在短短的時間內,CRISPR/Cas9已經以其豐富的潛力俘獲了科學家們的想象力,這讓人很難不好奇其中還蘊藏着什麼。

 

 

  1. Ishino, Y., et al.,Nucleotide sequence of the iap gene, responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli, and identification of the gene product.J Bacteriol,1987.169(12): p. 5429-33.
  2. Barrangou, R., et al.,CRISPR provides acquired resistance against viruses in prokaryotes.Science, 2007.科學》,2007年,315(5819): p. 1709-12。315(5819): p. 1709-12.
  3. Jinek, M., et al.,A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.Science, 2012.337(6096): p. 816-21.
  4. Sander, J.D. and J.K. Joung,CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes.Nat Biotechnol,2014。32(4): p. 347-55.
  5. Zhou, Y., et al.,High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells.Nature, 2014.509(7501): p. 487-91.
  6. Shalem, O., et al.,Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells.Science, 2014.343(6166): p. 84-7.
  7. Wang, T., et al.,Genetic screens in human cells using the CRISPR-Cas9 system.Science, 2014.343(6166): p. 80-4.
  8. Kasap, C., O. Elemento, and T.M. Kapoor,DrugTargetSeqR: a genomics- and CRISPR-Cas9-based method to analyze drug targets.Nat Chem Biol,2014。
  9. Wilding, J.L. and W.F. Bodmer,Cancer cell lines for drug discovery and development.癌症研究,2014。74(9): p. 2377-84.
  10. Yin, H., et al.,Genome editing with Cas9 in adult mice corrects a disease mutation and phenotype.Nat Biotechnol,2014.32(6): p. 551-3.
  11. Ghorbal, M., et al.,Genome editing in the human malaria parasite Plasmodium falciparum using the CRISPR-Cas9 system.Nat Biotechnol,2014。
  12. Liu, F., et al.,Comparative genomic analysis of Mycobacterium tuberculosis clinical isolates.BMC Genomics, 2014.15(1): p. 469.
  13. Palmer, K.L. and M.S. Gilmore,Multidrug-resistant enterocci lack CRISPR-cas.MBio, 2010.1(4).

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